Роль серотонина в регуляции взаимодействия нервной и иммунной систем при рассеянном склерозе

1 Рассеянный склероз Роль серотонина в регуляции взаимодействия нервной и иммунной систем при рассеянном склерозе М.В. Мельников 1, М.В. Пащенков 2, А.Н. Бойко 1 1 Кафедра неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики Лечебного факультета ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ РФ, Москва 2 Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Москва Проведено комплексное неврологическое и иммунологическое обследование 43 больных ремиттирующим рассеянным склерозом. Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale). Концентрацию серотонина в сыворотке крови измеряли методом иммуноферментного анализа. Функциональную активность T-хелперов 1-го и 17-го типов оценивали по способности продукции интерферона-γ и интерлейкина-17 мононуклеарными клетками периферической крови. Установлено, что продукция цитокинов у больных рассеянным склерозом в стадии обострения достоверно выше, чем у больных в стадии ремиссии и у здоровых доноров. Уровень серотонина был сопоставимым во всех группах. Серотонин в конечной концентрации 1 4 М оказывает ингибирующий эффект на продукцию интерлейкина-17. Ключевые слова: рассеянный склероз, серотонин, T-хелперы 17-го типа, интерлейкин-17. Введение Рассеянный склероз (РС) хроническое воспалительное демиелинизирующее и нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы с аутоиммунным механизмом развития. Одним из развивающихся направлений в изучении патогенеза РС является исследование нервно-иммунного взаимодействия [11]. Полагают, что ключевая роль в регуляции этого взаимодействия принадлежит нейротрансмиттерам, в частности биогенным аминам, имеющим рецепторы на клетках как нервной, так и иммунной системы [1]. Серотонин является одним из основных нейротрансмиттеров в центральной нервной системе, обладающих иммуномодулирующим эффектом и участвующих в патогенезе экспериментального Контактная информация: Мельников Михаил Валерьевич, аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) и РС. Установлено, что использование селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС) при ЭАЭ подавляет выработку провоспалительных цитокинов (интерлейкина-12 (ИЛ-12), интерферона-γ (ИФН-γ)), повышает уровень нейротрофического фактора мозга, противовоспалительного цитокина ИЛ-1, а также уменьшает выраженность клинических симптомов ЭАЭ [5, 15, 17, 19, 2]. Имеются данные о влиянии СИОЗС и на течение РС. Так, в исследовании C.I. Mitsonis et al. было установлено, что применение СИОЗС является эффективным методом профилактики стрессиндуцированных рецидивов РС у женщин [1]. Еще в одном исследовании было продемонстрировано снижение активности РС по данным магнитно-резонансной томографии на фоне применения флуоксетина, который также относится к группе СИОЗС [12]. 85

2 Результаты исследований Таблица 1. Клинико-демографические характеристики больных РС и контрольной группы на момент включения в исследование Показатель Больные РС обострение (n = 14) ремиссия (n = 29) Контрольная группа (n = 2) Возраст, годы 33 (28; 42) 31 (26; 47) 26,5 (25; 28) Мужчины/женщины, абс. 6/8 12/17 9/11 Длительность РС, годы 5 (3,3; 11,5) 6 (2; 9) EDSS, баллы 3 (2,6; 3,5) 1,5 (1; 3) Примечание. Здесь и в табл. 2: представлено значение медианы, в скобках 25-й и 75-й процентили. В целом влияние серотонина на иммунопатогенез РС не вызывает сомнений. В то же время воздействие серотонина на T-хелперы 1-го и 17-го типов, играющие ключевую патогенетическую роль при РС, недостаточно изучено. Таким образом, целью настоящего исследования явилось изучение возможных ассоциаций между клиническими характеристиками РС, функцио нальной активностью T-хелперов 1-го и 17-го типов, концентрацией серотонина в сыворотке крови, а также уточнение влияния серотонина на T-хелперы 1-го и 17-го типов in vitro. Материал и методы Пациенты Проведено комплексное клиническое и иммунологическое обследование 43 больных (18 мужчин, 25 женщин) в возрасте от 23 до 5 лет с достоверным диагнозом ремиттирующего РС по критериям McDonald в модификации от 25 г. [13]. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 1 до 15 лет (медиана 4,5 года). Все больные получали препараты, изменяющие течение РС (ПИТРС), первой линии: 25 больных глатирамера ацетат, 18 больных ИФН-β1b (медиана длительности лечения ПИТРС составила 4 года). У 29 пациентов имел место РС в стадии клиничес кой ремиссии, у 14 в стадии обострения. Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале EDSS (Expanded Disability Status Scale расширенная шкала оценки степе- 86 ни инвалидизации) [6]. На момент забора крови все больные более 3 мес не получали лечение глюкокортикостероидами (14 пациентам, находящимся в стадии обострения, терапия глюкокортикостероидами была проведена после забора крови) и более 6 мес не получали лечение антидепрессантами. Контрольную группу составили 2 условно здоровых доноров (9 мужчин, 11 женщин). Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Клинико-демографические характеристики больных РС и здоровых доноров представлены в табл. 1. Все больные подписали информированное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ РФ. Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови Для оценки функциональной активности T-хелперов 1-го и 17-го типов из венозной крови (взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с EDTA) выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (МНКПК) путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина ( ПанЭко, Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ph 7,3) и ресус пендировали в культуральной среде RPMI-164 ( ПанЭко ) c добавле нием 2 мm L-глутамина ( ПанЭко ) и 1% фетальной телячьей сыворотки ( Пан Эко ). Затем

3 (а) Рассеянный склероз (б) I II I II I II I II I II I II Больные РС, обострение (n = 14) Больные РС, ремиссия (n = 29) Контроль (n = 2) Рис. 1. Продукция ИЛ-17 (а) и ИФН-γ (б) МНКПК у больных РС и здоровых доноров in vitro. I спонтанная продукция, II продукция, стимулированная анти-cd3- и анти-cd28-антителами. Здесь и на рис. 2: горизонтальная линия в боксе значение медианы, нижняя и верхняя границы бокса 25-й и 75-й процентили, вертикальные линии диапазон значений. p <,5, p <,1. МНКПК в количестве в 2 мкл на лунку вносили в 96-луночный круглодонный планшет и стимулировали магнитными частицами, покрытыми анти-cd3- и анти- CD28-антителами (Life Technologies, Норвегия). Образцы инкубировали 72 ч в CO 2 - инкубаторе, после чего отбирали супернатант и замораживали при 7 С. Для оценки влияния серотонина на функциональную активность T-хелперов 1-го и 17-го типов часть образцов МНКПК стимулировали в присутствии серотонина (Sigma, США) в конечных концентрациях 1 4, 1 5 и 1 6 М. Иммуноферментный анализ Уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и ИФН-γ в супернатантах клеточной культуры, а также содержание серотонина в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы фирмы ebioscience (США), серотонина фирмы IBL (Австрия). Уровни всех аналитов выражали в. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Prizm 6. Для оценки различий между двумя независимыми группами применяли U-критерий Манна Уитни. Статистичес ки значимыми различия считались при р <,5. Результаты По клиническим и демографическим характеристикам больные РС, находящиеся в стадии обострения и в стадии ремиссии, не различались, хотя степень тяжести РС по шкале EDSS была несколько выше у больных, находящихся в стадии обострения (см. табл. 1). Согласно результатам ИФА, у больных РС в стадии обострения продукция ИЛ-17 и ИФН-γ стимулированными МНКПК была достоверно выше, чем у больных в стадии ремиссии и у здоровых доноров (рис. 1). Содержание серотонина в сыворотке крови было сопоставимым во всех группах (табл. 2). Внесение серотонина в конечной концентрации 1 4 М оказало достоверный ингибирующий эффект на продукцию ИЛ-17, в то время как на продукцию ИФН-γ не повлияло (рис. 2). Внесение серотонина в конечных концентрациях