Хонина Н.А. 1, Селедцова Н.В. 2, Тихонова М.А. 1, Овсянникова Т.В. 2, Черных Е.Р. 1

1 Иммунология репродукции Иммунология репродукции Коллектив авторов, 2014 УДК : ] Хонина Н.А. 1, Селедцова Н.В. 2, Тихонова М.А. 1, Овсянникова Т.В. 2, Черных Е.Р. 1 Содержание ругуляторных CD4 + CD25 + CD127 - T-клеток в циркуляции и эндометрии у фертильных и бесплодных женщин в разные фазы менструального цикла 1 ФБГУ Институт клинической иммунологии СО РАМН, , г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14; 2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, , г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 8 В работе проведено комплексное исследование содержания CD4 + CD25 + CD127 - Т-клеток в периферической крови и эндометриальной ткани в динамике менструального цикла у здоровых фертильных женщин (n = 12) и женщин с бесплодием неясного генеза (n = 12). Результаты исследования показали достоверное увеличение у фертильных женщин циркулирующих и эндометриальных Т-регуляторных клеток в фазу средней секреции. У женщин с бесплодием содержание CD4 + CD25 + CD127 - Т-клеток в динамике цикла не меняется. При сравнительном анализе, проведенном у женщин, установили, что у женщин с бесплодием количество регуляторных Т-клеток в крови и эндометрии в фазу средней секреции достоверно меньше, чем у фертильных женщин. Результаты анализа корреляционной связи между количеством CD4 + CD25 + CD127 клеток в крови и содержанием эстрадиола выявили прямую зависимость между указанными параметрами (r s = 0,59; p = 0,04; n = 24). Ключевые слова: бесплодие; регуляторные CD4 + CD25 + CD127 - Т-клетки; эстрадиол; периферическая кровь; эндометриальная ткань. Khonina N.A. 1, Seledtsova N.V. 2, Tikhonova M.A. 1, Ovsyanikova T.V. 2, Chernykh E.R. 1 CD4 + CD25 + CD127 - T cells in fertile women and women with unexplained infertility in different phases of menstrual cycle 1 Institute of Clinical Immunology of Russian Academy of Medical Sciences of Siberian Branch, , Novosibirsk, Russia; 2 Institute of Chemical Biology & Fundamental Medicine of Russian Academy Medical Sciences of Siberian Branch, , Novosibirsk, Russia The fluctuation of CD4 + CD25 + CD127 - T-cells in a peripheral, menstrual blood and an endometrial tissue in different phases of a normal menstrual cycle of healthy fertile women (n = 12) and women with unexplained infertility (n = 12) was evaluated. The data has showed the increase in number of T-cell in peripheral blood and endometrial tissue in fertile women in peri-implantation phase. In women with infertility number of CD4 + CD25 + CD127 - T cells does not change in the dynamics of the menstrual cycle. The comparative analysis has shown that women with infertility has significantly decreased number CD4 + CD25 + CD127 - T-cell both in peripheral blood and endometrial tissue. The analyses of correlation between CD4 + CD25 + CD127 - blood cells and estradiol revealed a direct relationship between these parameters (r s = 0,59; p = 0,04; n = 24). Key words: infertility; regulatory CD4 + CD25 + CD127 - T-cells; estradiol; peripheral blood; endometrial tissue Одним из приоритетных направлений репродуктивной иммунологии является изучение основных механизмов, контролирующих индукцию иммунологической толерантности. В этом аспекте важную роль отводят популяции регуляторных CD4 + CD25 + T-клеток (Тгeg), которые участвуют в формировании иммуносупрессорного фона при беременности, что позволяет имплантироваться и развиваться полуаллогенному плоду. Сообщения последних лет о способности Тгeg ингибировать цитотоксическую активность CD8 Т-лимфоцитов и натуральных киллерных клеток (НК) позволили рассматривать Тгeg в качестве основных претендентов на роль клеток, контролирующих баланс в системе мать плод [1]. Имеются данные, показывающие, что низкая экспрессия рецептора интерлейкина (IL)-7 (CD127) с коэкспрессией CD25 характерна Для корреспонденции: Хонина Наталья Алексеевна, e mail: For correspondence: Khonina Natalya Alekseevna, для Тгeg, которые характеризуются анергией и способны супрессировать ответ Т-клеток на аллоантигены в культурах in vitro [2, 3]. Супрессорный эффект Treg может иметь важное значение в ограничении нормального иммунного ответа, например, к аллоантигенам отца при беременности. В литературе представлено достаточно данных об иммунорегуляторной роли CD4 + CD25 + -клеток, в том числе подтверждающих их значение в формировании иммунологической толерантности при беременности. Известно, что физиологическое течение беременности сопровождается повышением содержания CD4 + CD25 + -клеток, а развитие гестационных осложнений ассоциировано с его снижением [4, 5]. В последние годы появились данные о повышении уровня CD4 + CD25 + CD127 клеток в крови у беременных и его снижении в децидуальной ткани у женщин со спонтанными выкидышами [6]. Согласно результатам исследований последних лет, роль Treg в репродуктивном процессе не ограничивается индукцией толерантности к аллоантигенам плода во время беременности, не исключается их участие 151

2 иммунология 3, 2014 в формировании системной [7, 8], локальной [9] иммуносупрессии в периовуляторный период. В экспериментальных работах показано, что перенос CD4 + CD25 + -клеток от здоровых беременных мышей на 1 2-й день самкам с дефицитом Treg (DBA/2J) предотвращал выкидыши и способствовал развитию беременности [10]. Очевидно, дефицит Treg в периовуляторном периоде ассоциирован с нарушением имплантации эмбриона и последующим выкидышем. Вероятно, накопление естественных и активация индуцибельных Treg в период открытия имплантационного окна находятся под контролем половых гормонов. Из данных литературы известно о вариабельности Т-, В-лимфоцитов, НК [11], дендритных клеток [12] и CD4 + CD25 + FoxP3-клеток [7] в динамике менструального цикла у здоровых женщин, а в культурах in vitro показано прямое влияние эстрадиола [13] на генерацию CD4 + CD клеток. Однако исследования по содержанию Treg в эндометрии в различные фазы цикла в норме и при патологии репродукции отсутствуют. В нашей работе планируется провести комплексное исследование содержания CD4 + CD25 + CD127 -клеток в периферической циркуляции и эндометриальной ткани в динамике менструального цикла у фертильных женщин и пациенток с бесплодием неясного генеза. Материалы и методы. Обследованы 12 женщин с бесплодием неясного генеза (1-я группа) и 12 фертильных женщин, имеющих детей (2-я группа, контроль). На момент исследования у женщин с бесплодием не выявили причину инфертильности (регулярный овуляторный менструальный цикл, проходимость маточных труб, фертильная сперма партнера, отсутствие анатомических дефектов репродуктивных органов, отсутствие гинекологических и эндокринных заболеваний). Средний возраст женщин в 1-й группе составил 29,5 ± 2,9 года, в контрольной 30,2 ± 1,3 года. Все манипуляции у женщин из обеих групп осуществляли с их информированного согласия. Факт овуляции оценивали с помощью динамической фолликулометрии. У всех женщин провели исследование содержания гормонов в сыворотке крови эстрадиола (2 4-й день цикла) и прогестерона (2 4-й и й дни цикла). Иммунологическое обследование проводили дважды в фолликулярную фазу (2 4-й день) и фазу средней секреции (5 7-й день после овуляции) менструального цикла. Для исследования у женщин забирали венозную кровь, менструальную кровь с помощью стерильного шприца и биоптат эндометриальной ткани, который получали путем аспирации с помощью внутриматочного зонда «Пайпель». Биоптаты помещали в холодный физиологический раствор, затем механически измельчали и фильтровали через стальное сито. Затем из крови и биоптата выделяли мононуклеарные клетки (МНК) в градиенте плотности фиколла верографина. Содержание регуляторных Treg T-клеток (CD4 + CD25 + CD127 - ) оценивали методом проточной цитометрии с использованием коктейля антител (Becton Dickinson, США) с применением программы Cell Quest. Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя программу STATISTICA 6.0. Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона Манна Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли, используя метод χ 2. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена. Результаты. При исследовании содержания CD4 + CD25 + CD клеток у фертильных женщин в периферической крови в начале цикла (фолликулярная фаза) и периовуляторный период (фаза средней секреции) установили, что Содержание (в %) CD4+CD25+CD127 - T-клеток в периферической крови и эндометриальной ткани у женщин в динамике менструального цикла. Количество T-клеток в периферической крови (а) и в эндометриальной ткани (б) фертильных женщин; количество T-клеток в периферической крови (в) и в эндометриальной ткани (г) женщин с бесплодием. 1 фолликулярная фаза; 2 фаза средней секреции. 152 количество Treg достоверно возрастает в динамике цикла (см. рисунок, а). При индивидуальном анализе увеличение количества CD4 + CD25 + CD127 -клеток в периферической крови регистрировали у 77% женщин. Аналогичные изменения выявили при исследовании уровня CD4 + CD25 + CD клеток в эндометриальной ткани, что проявилось достоверно более высоким содержанием Treg в эндометрии в периовуляторном периоде по сравнению с таковым в менструальной крови у женщин в начале цикла (см. рисунок, б). При этом повышение количества CD4 + CD25 + CD127 -клеток отметили у 86% женщин. При сравнительном анализе содержания CD4 + CD25 + CD127 -клеток в фолликулярной фазе цикла выявили тенденцию к более высокому количеству Treg в менструальной крови по сравнению с таковым в периферической крови (см. таблицу). Причем если в начале цикла содержание CD4 + CD25 + CD127 -клеток в менструальной и периферической крови различается на 18%, то в периовуляторный период в эндометрии накапливается на 32% больше клеток, чем в циркуляции (χ=0,02). Полученные данные впервые продемонстрировали повышение содержания эндометриальных CD4 + CD25 + CD127 -клеток у фертильных женщин в динамике менструального цикла, а также показали, что нарастание уровня Treg в периовуляторную фазу происходит как на системном, так и на локальном уровне, но в большей степени выражено в эндометриальной ткани. Результаты исследований, проведенных у женщин с бесплодием, не выявили значимых изменений в содержании циркулирующих CD4 + CD25 + CD клеток в динамике цикла (см. рисунок, в). При индивидуальном анализе повышение доли Treg в периферической крови регистрировали только у 27% женщин. Достоверных различий в содержании CD4 + CD25 + CD127 -клеток в менструальной крови у женщин в начале цикла и эндометриальной ткани в периовуляторный период также не обнаружили (см. рисунок, г). Только у 25% женщин увеличивалось количество Treg в эндометрии в динамике цикла. Содержание циркулирующих и эндометриальных Treg в фолликулярной и

3 Содержание (. ) CD4 + CD25 + CD клеток в периферической крови и эндометрии у фертильных женщин и женщин с бесплодием Параметр Группа женщин 1-я CD4 + CD25 + CD127 - (бесплодие) 2-я (контроль) Периферическая кровь фолликулярная фаза 4,5±0,63 4,0 6,5±0,7 7,0 фаза средней секреции 5,3±0,7** 5,0 9,6±1,1* 11,0 периовуляторной фазах цикла также не различалось. Следовательно, в отличие от фертильных женщин у женщин с бесплодием количество Treg в периферической циркуляции и эндометриальной ткани в динамике менструального цикла не увеличивается. При сравнительном анализе содержания CD4 + CD25 + CD клеток, проведенном у фертильных женщин и пациенток с бесплодием, выявили различия в количестве циркулирующих Treg (см. таблицу). Если в фолликулярной фазе цикла у женщин с бесплодием отметили тенденцию к более низкому количеству Treg (в 1,4 раза), то в периовуляторный период различия усиливались (в 1,8 раза) и становились значимыми. При этом у женщин с бесплодием содержание Treg в периовуляторном периоде осталось меньше, чем у фертильных женщин в начале цикла (5,3 ± 0,7 против 6,5 ± 0,7). Аналогичные различия выявили при сравнительном анализе содержания CD4 + CD25 + CD127 -клеток в эндометрии в оппозитных группах женщин. При бесплодии уровень Treg в менструальной крови был достоверно ниже (в 1,7 раза), чем у фертильных женщин. Так как у женщин с бесплодием количество CD4 + CD25 + CD127 -клеток в фазу средней секреции не меняется, то различия в содержании Treg в периовуляторный период в группах еще более увеличиваются. В итоге в эндометрии у женщин с бесплодием зарегистрировали в 2,4 раза меньше CD4 + CD25 + CD127 -клеток, чем в оппозитной группе. Как показали результаты сравнительного анализа, у женщин с бесплодием количество Treg в эндометрии в периовуляторную фазу остается меньше, чем у фертильных женщин в менструальной крови в начале цикла (5,2 ± 1,3 против 7,7 ± 1). Так, у 2/3 женщин с бесплодием содержание CD4 + CD25 + CD127 -клеток в эндометрии не достигает нижней границы интерквартильного диапазона Treg в менструальной крови у фертильных женщин, различия достоверны (χ 2 =0,04). Таким образом, женщины с бесплодием характеризуются более низким содержанием Treg в различные фазы цикла, чем фертильные женщины. При этом количество Treg в периовуляторный период у женщин с бесплодием остается меньше, чем у фертильных женщин в начале цикла. Согласно данным фолликулометрии у женщин, включенных в исследование, регистрировали овуляторный цикл, что предполагает достаточный уровень продукции репродуктивных гормонов. Поэтому можно предположить, что вариабельность содержания Treg в динамике менструального цикла зависит от концентрации эстрадиола и прогестерона в крови. В общей группе женщин уровень эстрадиола, определяемый на 2 4-й день цикла, варьировал в пределах референсных значений ( пмоль/л), составив в среднем 253 ± 45 пмоль/л. При анализе корреляционной связи между содержанием эстрадиола и количеством CD4 + CD25 + CD127 -клеток в крови в фолликулярной фазе цикла выявили прямую зависимость между указанными параметрами (r s =0,59; p=0,04; n=24). Уровень прогестерона в фазу средней секреции у всех женщин, за исключением одной, варьировал в пределах референсных значений (23,7 59,8 нмоль/л). Но корреляционной зависимости между количеством CD4 + CD25 + CD127 -клеток и уровнем прогестерона не отметили (r s =0,46; p=0,2; n=24). Эндометриальная ткань фолликулярная фаза 4,4±0,5** 4,1 7,7±1,0 7,5 153 фаза средней секреции 5,2±1,3** 4,2 12,7±1,5* 12,5 П р и м е ч а н и е. p < 0,05: * различия показателей у женщин в динамике менструального цикла, ** у женщин с бесплодием и фертильных женщин. Иммунология репродукции Обсуждение. Полученные результаты продемонстрировали изменения содержания CD4 + CD25 + CD127 -клеток в периферической крови в зависимости от фаз менструального цикла у фертильных женщин. Аналогичные данные по нарастанию количества CD4 + CD25 + FoxP3 + - клеток в периферической циркуляции в периовуляторный период представлены L. Arruvito и соавт. [7]. Но, как известно, наиболее значимые изменения в периимплантационный период происходят непосредственно в эндометрии. Показано, что рецептивность эндометрия повышается в период открытия имплантационного окна, который соответствует фазе средней секреции менструального цикла. Поэтому в своей работе мы расширили исследования и проанализировали динамику содержания CD4 + CD25 + CD127 -клеток не только в периферической циркуляции, но и в эндометрии. Впервые показали закономерные изменения содержания эндометриальных CD4 + CD25 + CD127 - клеток в разные фазы цикла и максимальное увеличение их количества в периовуляторный период. В последние годы представления о функциях Treg значительно расширились. Получены данные о способности Foxp3 + -клеток подавлять продукцию провоспалительных цитокинов, в частности IL-17 [14], и улучшать микроциркуляцию, препятствуя тромбообразованию [15]. Согласно экспериментальным данным, CD4 + CD25 + Treg способны повышать функциональную активность эндотелиальных клеток посредством ингибиции NADH-оксидазной активности [16]. В свою очередь эндотелиальные клетки повышают супрессорную функцию CD4 + CD25 + FoxP3 + -клеток [17]. Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что роль Treg в репродукции не ограничивается супрессорной функцией, важным моментом является их участие в контроле над балансом про- и противовоспалительных цитокинов и улучшении реологических свойств крови. В настоящей работе впервые показано, что увеличение количества CD4 + CD25 + CD127 -клеток в динамике менструального цикла характерно только при сохранной репродуктивной функции и не регистрируется при бесплодии. При этом результаты комплексных исследований, одновременно проведенных на системном уровне, в периферической крови, и локально, в эндометриальной ткани, позволили в целом оценить динамику содержания Treg: отмечено значимо более низкое количество CD4 + CD25 + CD127 клеток в периферической крови и эндометрии у женщин с бесплодием в разные фазы цикла. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, которые продемонстрировали, что в отличие от фертильных женщин у женщин с бесплодием количество циркулирующих CD4 + CD25 + FoxP3 + -клеток в периовуляторный период увеличивается незначительно и сопоставимо с таковым у женщин в менопаузе [7]. На значительное снижение доли CD4 + CD25 + FoxP3 + -клеток в эндометрии у женщин с бесплодием указывают также данные M. Jasper и соавт. [9]. Полученные результаты в совокупности с данными литературы позволяют рассматривать дефицит содержания регуляторных Т-клеток в периовуляторный период как одного из факторов, вовлеченных в патогенез бесплодия. Известно, что продукция репродуктивных гормонов значительно меняется в динамике менструального цикла, что может иметь большое значение для генерации Treg. Выявленная нами тесная корреляционная взаимосвязь между содержанием CD4 + CD25 + CD127 -клеток в крови и уровнем эстрадиола свидетельствует о том, что генерация Treg регулируется эстрогенами. Поскольку у всех женщин уровень эстрадиола в сыворотке крови колебался в пределах нормы и не различался в группах, то низкое количество CD4 + CD25 + CD127 -клеток у женщин с бесплодием может быть ассоциировано с дефицитом рецепторов к эстрадиолу на Treg. Таким образом, влияние половых гормонов